サルメテロールを始めとするβ2刺激剤は、筋量増加効果がありドーピング禁止薬の1つです。頻脈等の合併症はありますが、サルコペニア治療薬の候補の1つです。このサルメテロールの作用をin vitroで検討した論文を引用します。in vitroではアポトーシスを誘発してしまっていますが、実際の臨床では筋量は増加しています。このメカニズムが気になるところです。

Med Sci Sports Exerc. 2011 Dec;43(12):2259-73. doi: 10.1249/MSS.0b013e3182223094.

Effects of salmeterol on skeletal muscle cells: metabolic and proapoptotic features.

Duranti, et al.

サルメテロールの骨格筋での作用；　代謝とアポトーシスから。

目的：　サルメテロールは、β2アドレナリン受容体作動薬で、喘息やCOPDの治療に用いられる。スポーツでは、高容量を用いることにより機能を促進する薬として用いられる。β作動薬の乱用は副作用があるだろうが、サルメテロールの骨格筋に対する作用の分子機構は未だはっきりしないs。

方法：　サルメテロールの分化及び増殖の作用（0.1μM―10μM）をL6C5とC2C12細胞株を用いて評価した。代謝の効果は、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ (NADP+)（解糖系/糖新生を構成する酵素）、乳酸脱水素酵素（嫌気性解糖系の最終段階である乳酸 ⇔ ピルビン酸の反応を触媒する酵素）、クエン酸合成酵素（糖酸化過程において中心的な役割を果たす酵素の一つで、クエン酸回路（クレブス回路とも呼ばれる）の最初の段階に関わっている）、3-OH acyl-CoA dehydrogenase、アラニン　トランスグルタミナーゼ（タンパク質とタンパク質をつなぎ合わせる活性）　の活性を見た。　細胞毒性とアポート-シスは、MTSアッセイ、トリパンブルー色素排除試験法（青色のトリパンブルー色素が生細胞には取り込まれないことを利用し、生きている細胞と死んだ細胞を顕微鏡下で区別する手法）TUNEL assay（terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling assay）(アポトーシスに伴って切断されたDNAの末端をラベルする方法です｡酵素TdTを用いてDNA末端にビオチン標識ｄUTPを結合させ、さらにFITC－アビジン複合体を結合させて蛍光顕微鏡で観察したりFACSで測定)、ウェスタンブロット、免疫蛍光染色で評価した。

結果：　

トリパンブルー色素排除試験法

Fig1　MTSアッセイで細胞増殖が低値の理由は、10μMで死亡した細胞が多いから。

Fig2　6日目以降から、有意差をもって、コントロールよりもsalmeterol投与群の方が生存率が低い。

Fig3　10μM　6時間　salmeterolに暴露。

ブラッドフォード法：　Bradford method。タンパク質定量法。　クマシーG250は、単独の酸性溶液では465nmに可視光の吸収極大を持ち褐色を呈するが、タンパク質に結合すると吸収極大が595nmに移動し青色に見えることを利用。

GAPDH：　解糖系/糖新生を構成する酵素、LDH:　乳酸脱水素酵素（嫌気性解糖系の最終段階である乳酸 ⇔ ピルビン酸の反応を触媒する酵素）、CS：　クエン酸合成酵素。好気性解糖の指標。HAD：　好気性脂肪代謝の指標。

ALT：　アミノ酸代謝の指標。　（タンパク質とタンパク質をつなぎ合わせる活性）　

　短期間の治療でも、好気性代謝が活性化されていた。　GAPDH、CS、HAD、ALTがコントロールより上昇。　逆にLDHは減少。 

Fig4　Hoechst：　DNAを染色TUNEL assay　：　アポトーシスに伴って切断されたDNAの末端をラベルする方法です｡蛍光顕微鏡で観察。 

中期の高濃度Salmeterolにより、細胞分裂が休止し、アポトーシスが増える。

Fig5　アポトーシスのパスウェイ　

外因性パスウェイ：細胞表面の細胞死レセプターとcapsase8 、

内因性パスウェイ：　 capsase9とミトコンドリアを介し、PARP, Bcl-2蛋白の活性、Smac/DIABLOパスウェイを活性化する。　　

Fig6　アポトーシスに際し、ミトコンドリアは局在と形状を変える。　Smac/DIABLOは通常ミトコンドリアにある。これを免疫染色した。

A　Smac/DIABLO　通常の細胞はクモの巣状に染まるのに対し、Salmeterol治療後、Smac/DIABLO　細胞質全体に観察され、ミトコンドリアは核の周りに集中している。

B　Smac/DIABLO　の観察された細胞数。

結語として　６時間のサルメテロールの治療が筋肉細胞の代謝活性に効果的だ。　しかし、容量、時間依存的に細胞毒性がある。　中長期の使用は内因性のアポトーシスパスウェイを活性化させ、細胞毒性を発揮する。